บทคัดย่อ
           เชื้อ xylose-recombinant Saccharomyces cerevisiae (strain IM2) ซึ่งมียีน xylose reductase และ xylitol dehydrogenase
แทรกอยู่บนโครโมโซม สามารถสร้างเอนไซม์ทั้งสองชนิดได้โดยไม่ต้องมีไซโลสเป็นตัวกระตุ้นทำให้ใช้ไซโลสและกลูโคสได้พร้อมกัน เมื่อเลี้ยง recombinant IM2
ในสภาพที่ให้อากาศด้วยอาหารที่มีน้ำตาลผสมระหว่างไซโลสและกลูโคสความเข้มข้น 3% ในอัตราส่วนต่างๆ (10:0 9:1 7:3 5:5 และ 3:7)พบว่ากลูโคสช่วย
ให้การเจริญของ recombinant IM2 ในไซโลสดีขึ้น และเมื่อศึกษาถึง อิทธิพลของ pH แหล่งไนโตรเจน และปริมาณ dissolved oxygen ที่มีผลต่อการเจริญ
ของ recombinant IM2 เปรียบเทียบกับ Pichia stipitis ซึ่งเป็นยีสต์ที่ใช้ไซโลสได้ดี ในไฮโดรไลเสทของฟางข้าวซึ่งประกอบด้วยไซโลส 2.5-3.0% และกลูโคส 0.1-0.3% พบว่า recombinant IM2 สามารถเจริญในไฮโดรไลเสทได้ดีกว่า P. stipitis

                                                                                       Abstract
      Xylose-assimilating recombinant Saccharomyces cerevisiae (strain IM2), constructed by integrating the xylose reductase
and xylitol dehydrogenase genes onto the chromosome produced both enzymes constitutively and could utilize xylose
together with glucose. Aerobic cultivation of this recombinant in the medium containing 3% xylose-glucose mixture at various
ratio (10:0, 9:1, 7:3, 5:5 and 3:7) indicated the growth enhancement in the presence of glucose. Rice straw, one of the abundant
agricultural waste, was hydrolyzed by 1.5% sulfuric acid at 121^oC for 30 min and yielded a mixture of 2.5-3% xylose and 0.1-0.3%
glucose. Effect of N-source, pH, temperature and dissolved oxygen on growth and fermentation ability of the recombinant IM2
were carried out and compared with P. stipitis, the effective xylose-utilizing yeast. The results showed that the recombinant IM2
grew in the rice straw hydrolysate better than P. stipitis.

                                                                                          คำนำ
            ในแต่ละปีประเทศไทยมีวัสดุเกษตรเหลือใช้มากมาย เช่น ฟางข้าว ชานอ้อย และซังข้าวโพด เป็นต้น หากสามารถนำวัสดุเหล่านี้มาแปรรูปเป็นสารที่มีราคาและ
เป็น ที่ต้องการของอุตสาหกรรม เช่น การผลิตจุลินทรีย์โปรตีน การผลิตแอลกอฮอล์เพื่อพลังงาน นอกจากจะช่วยพัฒนาเศรษฐกิจของประเทศ ยังช่วยลดมลภาวะได้อีก
ด้วย วัสดุเกษตรเป็นสารประกอบลิกโนเซลลูโลสและเมื่อย่อยสลายด้วยกรดหรือเอนไซม์จะได้สารผสมของน้ำตาลซึ่งส่วนใหญ่เป็นกลูโคสและไซโลส แต่เนื่องจาก
Saccharomyces cerevisiae ไม่สามารถนำไซโลสไปใช้ได้¹ จึงมีการนำเทคนิคทางพันธุวิศวกรรมมาประยุกต์ใช้ และสร้าง xylose-assimilating
recombinant S. cerevisiae ที่สามารถผลิตแอลกอฮอล์จากไซโลสได้^2,3 ซึ่งในการศึกษาเบื้องต้นนั้นได้ใช้ไซโลสบริสุทธิ์เป็นแหล่งคาร์บอนดังนั้นในการศึกษา
ครั้งนี้จึงได้ใช้ไฮโดรไลเสทที่ได้จากการย่อยสลายฟางข้าวด้วยกรดเป็นแหล่งคาร์บอนเพื่อศึกษาความเป็นไปได้ในการนำ recombinant S. cerevisiae IM2
ไปใช้ในการแปรรูปวัสดุเกษตรให้มีประโยชน์สูงสุด

                                                                                  อุปกรณ์และวิธีการ
           จุลินทรีย์ที่ใช้ศึกษา:- Pichia stipitis CBS5773 และ xylose-assimilating recombinant Saccharomyces cerevisiae IM2 อาหาร
เลี้ยงเชื้อและสภาพการเลี้ยงเชื้อ:- เลี้ยงเชื้อทั้งสองในอาหาร YPXG (1% yeast extract, 2% peptone และน้ำตาลผสมระหว่างไซโลสและกลูโคสความเข้มข้น
3%) และในไฮโดรไลเสทของฟางข้าวซึ่งบรรจุในฟลาสก์ขนาด 500 มล.อ โดยปรับสภาพต่างๆเพื่อศึกษาสภาพที่เหมาะสมต่อการเจริญ ได้แก่ชนิดและปริมาณธาต
ุอาหารเสริม ค่า pH เริ่มต้น อุณหภูมิ และปริมาณ dissolved oxygen (DO) แล้วนำไปบ่มใน incubator shaker ด้วยความเร็ว 200 รอบต่อนาที เก็บตัวอย่าง
ทุกๆ 24 ชั่วโมง เป็นเวลา 3 วัน
           การเตรียมไฮโดรไลเสทของฟางข้าว:- นำฟางข้าวบดละเอียดมาย่อยสลายด้วยกรดกำมะถัน 1.5% โดยใช้ฟางข้าวและกรดในอัตราส่วน 1:6 ที่อุณหภูมิ
121^oC นาน 30 นาที กรองด้วยผ้าขาวบางและกระดาษกรองแล้วนำไปปรับ pH ด้วย 20% NaOH

                                                                                     ผลและวิจารณ์
           xylose-assimilating recombinant Saccharomyces cerevisiae IM2 เป็น recombinant ที่เกิดจากการชักนำยีนที่เกี่ยวข้องกับ xylose
metabolism จาก Pichia stipitis คือ xylose reductase และ xylitol dehydrogenase gene ที่อยู่บนพลาสมิด pEXGD8 เข้าสู่ S. cerevisiae²
และทำให้ยีนทั้งสองแทรกอยู่บนโครโมโซม³ (ภาพที่ 1) และสามารถสร้างเอนไซม์ทั้งสองชนิดได้โดยไม่ต้องมีไซโลสเป็นตัวกระตุ้น

              เมื่อเลี้ยง recombinant IM2 ในอาหาร YPXG ที่มีน้ำตาลผสมระหว่างไซโลสและกลูโคสความเข้มข้น 3% ในอัตราส่วนต่างๆ คือ 10:0 9:1 7:3 5:5
และ 3:7 ในสภาพที่ให้อากาศ พบว่า recombinant IM2 เจริญในอาหารที่มีไซโลสและกลูโคสได้ดีกว่าอาหารที่มีไซโลสเพียงอย่างเดียวและสามารถใช้น้ำตาล
ได้เร็วขึ้นโดยเฉพาะใน 24 ชั่วโมงแรก (ภาพที่ 2) แสดงว่า กลูโคสมีส่วนช่วยให้การเจริญของ recombinant IM2 ในไซโลสดีขึ้น ซึ่งต่างไปจาก xylose-
assimilating yeast ปกติที่กลูโคสจะมีผลชลอการไซโลสไปใช้^4,5
              ดังนั้นไฮโดรไลเสทของวัสดุเกษตร เช่น ฟางข้าวที่มีไซโลส 2.5-3.0% และ กลูโคส 0.1-0.3% เป็นองค์ประกอบ จึงเป็นวัตถุดิบที่สามารถนำไปใช้เลี้ยง
recombinant IM2 ได้ และเมื่อทดลองหาสภาพที่เหมาะสมในการเจริญของ recombinant IM2 โดยเปรียบเทียบกับ P. stipitis ได้ผลดังนี้
         ชนิดและปริมาณธาตุอาหาร การเติมธาตุอาหารเสริมสามารถเพิ่มการเจริญของ recombinant IM2 และ P. stipitis ได้โดยธาตุอาหารเสริมสูตรที่ 2
คือ 0.2% urea 0.3% KH₂PO₄ และ 0.025% MgSO₄.7H₂O จะทำให้เชื้อทั้งสองมีการเจริญสูงสุดในเวลา 3 วัน (ภาพที่ 3)

Fig. 3 Cell growth of recombinant IM2 and P. stipitis in supplementedrice straw hydrolysate
              F1; 0.1% urea, 0.3% KH₂PO₄ and 0.025% MgSO₄.7H₂O
              F2; 0.2% urea, 0.3% KH₂PO₄ and 0.025% MgSO₄ .7H₂O
              F3; 0.4% urea, 0.3% KH₂PO₄ and 0.025% MgSO₄ .7H₂O
              F4; 0.1% yeast extract, 0.1% urea, 0.3% KH₂PO₄ and 0.025% MgSO₄ .7H₂O
              F5; 0.4% yeast extract, 0.47% (NH₄)₂SO₄, 0.11% KH₂PO₄, 0.05% Na₂HPO₄, and 0.05% MgSO₄ .7H₂O
              F6; no supplement added

          pH เริ่มต้น recombinant IM2 เจริญได้ดีในไฮโดรไลเสทที่มี pH เริ่มต้นระหว่าง 4.0-7.0 ในขณะที่ P. stipitis เจริญได้ในไฮโดรไลเสทที่มี pH
เริ่มต้นระหว่าง 5.0-7.0 แต่อย่างไรก็ตามเมื่อเลี้ยงเชื้อทั้งสองชนิดในอาหาร YPXG ที่มี pH เริ่มต้นเช่นเดียวกับในไฮโดรไลเสทพบว่าเชื้อทั้งสองชนิดนั้นเจริญได้ดี
ในทุก pH (ภาพที่ 4) แสดงให้เห็นว่าสารที่ยับยั้งการเจริญของ P. stipitis น่าจะเป็น inhibitor อื่นในไฮโดรไลเสทและการปรับ pH ให้เป็นกลางมากขึ้นจะช่วยลด
ความเป็นพิษของ inhibitor ที่มีต่อ P. stipitis นอกจากนี้ยังแสดงว่า recombinant IM2 ทนต่อ inhibitor ต่างๆได้ดีกว่า P. stipitis และจากการทดสอบยืนยัน
ด้วย acetic acid ซึ่งเป็น inhibitor ชนิดหนึ่งที่พบใน hydrolysate^6,7 พบว่า recombinant IM2 ทนต่อ 0.5 % acetic acid ได้ ส่วน P. stipitis
ไม่สามารถเจริญในอาหารที่มี acetic acid

Fig. 4 Effect of pH on growth of recombinant IM2 and P. stipitis in rice hydrolysate (I) and YPXG
medium (II)

             อณหภูมิ recombinant IM2 และ P. stipitis เจิรญได้ในช่วงอุณหภูมิ 28-37^oC โดย recombinant IM2 มีแนวโน้มทนต่ออุณหภูมิสูงได้ดีกว่า
P. stipitis (ภาพที่ 5)
                ปริมาณ dissolved oxygen recombinant IM2 และ P. stipitis มีการเจริญสูงสุดเมื่อเลี้ยงในไฮโดรไลเสทปริมาตร 100 มล.ซึ่งบรรจุอยู่ในฟลาสก์
ขนาด 500 มล. และการเจริญจะลดลงเมื่อ ปริมาตรของไฮโดรไลเสทเพิ่มขึ้นมีผลให้ปริมาณ DO ลดลง แต่ถ้าพิจารณาถึงการผลิตแอลกอฮอล์ พบว่า recombinant
IM2 จะสร้างแอลกอฮอล์เพิ่มขึ้นเมื่อปริมาณ DO ลดลง ส่วน P. stipitis นั้นต้องการ oxygen ทั้งเพื่อการเจริญและการสร้างแอลกอฮอล์ (ภาพที่ 6) ทั้งนี้เป็นผลมาจาก
custer effect ที่เกิดขึ้นในสภาพที่มีอากาศจำกัด⁸ ดังนั้น oxygen จึงเป็นตัวแปรที่สำคัญที่ใช้ในการควบคุมการผลิตเพื่อให้การเจริญและผลิตแอลกอฮอล์จากไซโลส
ของ recombinant IM2 และ P. stipitis เป็นไปอย่างเหมาะสมและมีประสิทธิภาพสูงสุด

Fig. 5   Effect of temperature on growth of recombinant IM2 and P. stipitis

Fig. 6 Effect of medium volume on cell growth (I) and ethanol production (II) of recombinant IM2 and
             P. stipitis in rice straw hydrolysate

       
                จากผลการทดลองนี้สรุปได้ว่า recombinant IM2 เจริญได้ดีในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีไซโลสและกลูโคสเป็นแหล่งคาร์บอนและเจริญในไฮโดรไลเสท
ของฟางข้าวได้ดีกว่า P. stipitis และมีการเจริญสูงสุดในไฮโดรไลเสทที่เติม 0.2% urea 0.3% KH₂PO₄ และ 0.025% MgSO₄.7H₂O เป็นธาตุอาหาร
เสริม ปรับ pH เริ่มต้นระหว่าง 4-7 ปริมาตร 100 มล. บรรจุในฟลาสก์ขนาด 500 มล. แล้วนำไปบ่มใน incubator shaker อุณหภูมิ 30-35^oC ที่ความเร็ว
200 รอบต่อนาที เป็นเวลา 3 วัน และมีปริมาณ dissolved oxygen เป็นปัจจัยสำคัญในการควบคุมขบวนการหมักแอลกอฮอล์ของ recombinant IM2

                                                                                                              เอกสารอ้างอิง
1. Batt, C. A., S. Carvallo, Jr. D. D. Easson, M. Akedo and A. J. Sinsky. 1986. Biotechnol. Bioeng. 28:549-553.
2. Tantirungkij, M., N. Nakashima, T. Seki and T. Yoshida. 1993. J. Ferment. Bioeng. 75:83-88.
3. Tantirungkij, M., I. Tamaki, T. Seki and T. Yoshida. 1994. Appl. Microbiol. Biotechnol. 41:8-12.
4. Panchal, C. J., L. Bast, I. Russel and G. G. Stewart. 1988. Can. J. Microbiol. 34:1316-1320.
5. Grootjen, D. R. J., M. L. Jensen, R. G. J. M. van der Lans and K. Ch. A. M. Luyben. 1991. Enzyme Microb. Technol.
    13:828-833.
6. Vanzyl, C., B. A. Prior and J. C. du Preez. 1988. Appl. Biochem. Biotechnol. 17:357-369.
7.. . 1991. Enzyme Microb. Technol. 13:82-86.
8. Laplace, J. M., J. P. Delgenes, R. Moletta and J. M. Navarro. 1991. Appl. Microbiol. Biotechnol. 36:158-162.