บทคัดย่อ
                งานวิจัยนี้ได้ศึกษาเทคนิคการถ่ายยีนเข้าสู่แคลลัสชนิด embryogenic callus ที่เจริญมาจากใบของกุหลาบ (Rosa hybrida) พันธุ์ Carl Red โดย
ใช้เชื้อ Agrobacterium tumefaciens (A281/pBI121 ) เป็นพาหะ ซึ่งเชื้อ A281/pBI121 มี GUS gene เป็น marker gene และมี kanamycin
เป็น antibiotic resistant gene (NPTII gene) จากการทดลองพบว่าสามารถคัดเลือกแคลลัสที่ต้านทานต่อ kanamycin ที่ระดับความเข้มข้น 100 มก/ล.
ได้ประมาณ 15 % จากจำนวนแคลลัสทั้งหมด เมื่อนำแคลลัสที่ต้านทานต่อ kanamycin เหล่านี้มาทดสอบ GUS activity พบจุดสีน้ำเงินบนก้อนแคลลัสและภาย
ในเซลล์ จากนั้นนำ transformed calli เหล่านี้ไปตรวจสอบด้วยวิธี polymerase chain reaction (PCR) เพื่อยืนยันในระดับ DNA หลังจากตรวจสอบด้วย
gel electrophoresis แล้วพบ band ที่แสดง GUS gene ที่ระดับ 1.2 kb และ band ที่แสดง NPT II gene ที่ระดับ 0.7 kb ใน transgenic calli
ที่ตรวจสอบ การทดลองนี้สามารถนำเทคนิคไปปรับใช้ในการสร้างระบบการถ่ายยีนอื่นๆที่มีความสำคัญทางเศรษฐกิจให้กับกุหลาบหรือไม้ดอกเศรษฐกิจชนิดอื่นเพื่อ
ใช้ในการปรับปรุงพันธุ์ต่อไป
 
                                                                                                        Abstract
             This research studied on the techniques for gene transfer into embryogenic callus derived from leaves of rose
(Rosa hybrida) cv Carl Red by using Agrobacterium tumefaciens (A281/pBI121) as a vector. A281/pBI121 consists of
NPT  II gene controling kanamycin resistant gene and GUS gene as a marker gene. The experiment showed that
kanamycin - resistant calli in concentration 100 mg/l were selected from the total calli, approximately 15 percent.
Kanamycin resistant calli were checked the GUS activity and showed strong GUS expression (blue spot) on calli and
cells. Kanamycin - resistant calli obtained after treated with A281/pBI 121 were confirmed by PCR analysis. The
predicted 1.2 kb band for GUS gene and 0.7 kb band for NPT II gene were detected in these transgenic calli while these
bands were not detected in the untransformed control calli by using Agrobacteium tumefaciens . These techniques
obtained will be utilized to transfer economical gene into rose or another economical cut flowers for further plant
improvement.

                                                                                                            คำนำ
           กุหลาบเป็นไม้ดอกเศรษฐกิจที่มีความสำคัญมากชนิดหนึ่งในโลก การปรับปรุงพันธุ์กุหลาบเพื่อให้มีคุณภาพดีนั้นสามารถทำได้โดยวิธีการคัดเลือก และ
ผสมพันธุ์ ซึ่งต้องอาศัยเวลา ความชำนาญและประสบการณ์ ในปัจจุบันนี้ได้มีการนำเทคโนโลยีชีวภาพมาใช้ในการสร้างพืชพันธุ์ใหม่ให้มีคุณสมบัติตามที่ต้องการ
ซึ่งเทคนิคนี้สามารถทำได้หลายวิธีเช่น การใช้เชื้ออะโกรแบคทีเรีย เป็นพาหะในการถ่ายยีน (Agrobacterium - mediated gene transfer) การใช้เครื่อง
ยิงอนุภาค (Biolistic bombardment) การรวมโปรโตพลาสต์ (protoplast fusion) เป็นต้น ซึ่งการเลือกใช้วิธีใดนั้นขึ้นอยู่กับชนิดและเนื้อเยื่อของพืช
ตลอดจนองค์ประกอบต่างๆ ที่เป็นปัจจัยร่วม เช่น ความยากง่ายในการแสดงออกของยีน ความคงทนของยีนตลอดจนอุปกรณ์เครื่องมือและค่าใช้จ่ายสำหรับ
การทดลองในแต่ละครั้ง เป็นต้น สำหรับวัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้คือศึกษาเทคนิคการถ่ายยีนในกุหลาบ (Rosa hybrida) พันธุ์ Carl Red (รูปที่ 1) โดย
ใช้เชื้อ Agrobacterium tumefaciens เป็นพาหะ

                                                                                                อุปกรณ์และวิธีการ

        1. การเพาะเลี้ยงใบกุหลาบในสภาพปลอดเชื้อ
                 นำใบของกุหลาบที่ได้จากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อมาตัดออกเป็น 2 ชิ้นเท่ากัน จากนั้นนำใบเหล่านั้นมาทดลองเลี้ยงในอาหารสูตร MS ที่เติมสาร
ควบคุม การเจริญเติบโตในกลุ่ม auxin คือ a – naphthalene acetic acid (NAA) , 2,4 – dichlorophenoxyacetic acetic (2,4-D) acid
และ indolebutyric acid (IBA) ความเข้มข้นตั้งแต่ 0.25 – 10 มก./ล. ตามวิธีของ Visessuwan et al 1997 จากนั้นนำมาเก็บไว้ในห้องควบคุม
อุณหภูมิและแสงเป็นเวลา 2 เดือน เพื่อสังเกตการเกิดแคลลัส
       2. การเลี้ยงเชื้อ Agrobacterium tumefaciens (A281/pBI 121) ร่วมกับแคลลัสชนิด embryogenic callus
                  นำแคลลัสที่มีสีเหลืองอมขาว ผิวเรียบ ซึ่งเป็นแคลลัสชนิด embryogenic callus มาแช่ในอาหาร เหลวสูตร LB ที่เลี้ยงเชื้อ A281/pBI
แล้วทิ้งไว้ประมาณ 10 นาที โดยวางบนเครื่องเขย่าความเร็วรอบประมาณ 100 rpm เมื่อครบเวลานำแคลลัสมาวางบนกระดาษกรองที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้วเพื่อซับเชื้อ
แบคทีเรียออกบางส่วน จากนั้นย้ายมาเลี้ยงในอาหารสูตร MS ที่เติม BA 2 มก./ล. เป็นเวลา 3 วัน เมื่อครบเวลา ย้ายมาเลี้ยงในอาหารสูตรเดิมที่เติม claforan
500 มก./ล. เพื่อฆ่าเชื้อแบคทีเรีย เปลี่ยนอาหารใหม่ทุก 2 สัปดาห์ โดยย้ายมาเลี้ยงในอาหารที่เติม claforan ลดลงเหลือ 200 มก./ล. ร่วมกับ kanamycin
50 มก./ล. และค่อยๆ ลดความเข้มข้นของ claforan ลงแต่เพิ่มความเข้มข้นของ kanamycin เป็น 100 มก./ล. เปลี่ยนอาหารประมาณ 3-4 ครั้ง เพื่อคัดเลือก
แคลลัสที่ต้านทานต่อ kanamycin
           3. การตรวจสอบ transgenic callus
                         3.1   ตรวจสอบ transgenic callus โดยวิธี GUS assay
                                 นำแคลลัสที่ต้านทานต่อยา kanamycin มาแช่ในสารละลาย X - Gluc เป็นเวลา 4 ชั่วโมง อุณหภูมิประมาณ 37 ? C ตามวิธีของ
Jefferson et al (1987) จากนั้นนำมาตรวจสอบ GUS expression ซึ่งดูจากการเกิด blue spot ภายใต้กล้องจุลทรรศน์
                         3.2 ตรวจสอบโดยใช้ poly merase chain reaction (PCR) analysis
                                นำแคลลัสที่ต้านทานต่อยา kanamycin (transgenic callus) มาสกัด DNA ตามวิธีของ Sambrook et al (1989) จากนั้นตรวจ
หายีน GUS และ NPT IIโดยวิธี PCR ซึ่งวิเคราะห์ขนาดและชนิดของ DNA ที่สกัดจาก transgenic callus ด้วย 0.8% agarose gel
electrophoresis ใช้ primer สำหรับตรวจสอบ GUS และ NPT II gene ตามวิธีของ Hannill et al (1991) โดย band ของ GUS gene และ
NPT II gene จะอยู่ที่ 1200 bp และ 700 bp ตามลำดับ

                                                                         ผลการทดลอง
1. การเพาะเลี้ยงใบของกุหลาบ
            เมื่อนำต้นที่ได้จากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อของกุหลาบ มาตัดใบออกเป็น 2 ส่วนเท่ากันและเลี้ยงในอาหารแข็งสูตร MS ที่เติมสารควบคุมการเจริญเติบโต
NAA, 2,4-D หรือ IBA ในความเข้มข้นตั้งแต่ 0.25-10 มก./ล. นั้นพบว่าแคลลัสสามารถเจริญที่บริเวณรอยตัดของใบและพบแคลลัสมีสีเหลืองอมขาวเกิดขึ้น
ในอาหารสูตร MS ที่เติม NAA 0.5 มก./ล. (รูปที่ 2) จึงคัดเลือกเฉพาะแคลลัสสีเหลือง มาทดสอบโดยเลี้ยงในอาหารสูตร MS ที่เติม BA 2 มก./ล. และ
แคลัลสเหล่านี้สามารถพัฒนาเกิดเป็นต้นอ่อนได้ จึงเรียกว่าเป็นแคลลัสชนิด embryognic callus (รูปที่ 3) ซึ่งจะนำมาใช้ในการทดลองที่ 2

2. การเลี้ยงเชื้อ Agrobacterium tumefaciens (A281/pBI 121) ร่วมกับ embryogenic callus
               หลังจากนำแคลลัสที่มีสีเหลืองอมขาว ผิวเรียบ (embryogenic callus) มาเลี้ยงร่วมกับแบคทีเรีย Agrobacterium tumefaciens (A281/
pBI 121) เป็นเวลาประมาณ 3-4 เดือนเพื่อคัดเลือกแคลลัสที่ต้านทานต่อ kanamycin ในอาหารสูตร MS ที่เติม BA และ claforan 200 มก./ล. ร่วมกับ
kanamycin 100 มก./ล. นั้น พบว่าสามารถคัดเลือกแคลลัสที่ต้านทานต่อ kanamycin ความเข้มข้น 100 มก/ล. ได้ประมาณ 15 % จากจำนวนแคลลัสทั้งหมด

(ก)

(ข)

3. การตรวจสอบ transgenic callusโดยวิธี GUS assay และ polymerase chain reaction (PCR) analysis
            หลังจากนำแคลลัสที่ต้านทานต่อ kanamycin มาแช่ในสารละลาย X - Gluc เป็นเวลา 4 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 37 ? C พบว่าเกิดจุดสีน้ำเงินบนก้อน
แคลลัสและภายในเซลล์สังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์(ดังแสดงในรูปที่ 4 ก, ข) จึงสันนิฐานว่าแคลลัสเหล่านี้ได้รับการถ่ายยีน GUS และ NPT II แล้ว จึงนำ
transform ed calli เหล่านี้ไปตรวจสอบด้วยวิธี PCR เพื่อยืนยันในระดับ DNA เมื่อตรวจสอบด้วย agarose gel electrophoresis แล้วพบ band
ที่แสดง GUS gene ที่ระดับ 1.2 kb และ band ที่แสดง NPT II gene ที่ระดับ 0.7 kb ใน transgenic calli ที่ตรวจสอบ (รูปที่ 5)

                                                                                                    วิจารณ์
             งานวิจัยนี้สามารถถ่ายยีนเข้าสู่กุหลาบโดยใช้เชื้อ Agrobacterium tumefaciens (A281/pBI) ได้และมีประสิทธิภาพดีเนื่องจากเชื้อแบคทีเรียที่
ใช้จะเป็น strain ที่รุนแรงจึงสามารถชักนำให้เกิด transgenic callus ได้แต่เนื่องจากแบคทีเรีย strain นี้มีความสามารถในการสร้างแคลลัสสูง (tumor
inducing) จึงมีผลต่อการลดความสามารถในการชักนำให้เป็นต้นของแคลลัส (embryogenic callus) แต่อย่างไรก็ตามงานทดลองนี้ทำให้ทราบเทคนิค
พื้นฐานและขั้นตอนต่างๆ ที่มีผลต่อการถ่ายยีนเข้าสู่กุหลาบสำหรับการทดลองต่อไปหากมีการใช้แบคทีเรีย strain อื่นเช่น LBA4404 , EHA101 หรือตัวอื่นๆ
ที่ไม่มีผลต่อการชักนำให้เกิด tumor อย่างรุนแรงจะมีโอกาสในการชักนำให้แคลลัสเกิดเป็นต้นได้มากขึ้น สำหรับการศึกษานี้ใช้ embryogenic callus เป็นตัว
รับยีนนั้นจะมีประสิทธิภาพดีและเหมาะสม เพราะembryogenic callus มีความสามารถชักนำให้เกิดเป็นต้นได้ หากมีการเปลี่ยนแปลงใช้แบคทีเรีย strain อื่น
                 การเพาะเลี้ยงใบกุหลาบ การใช้สารเร่งการเจริญเติบโต NAA จะมีอิทธิพลสูงต่อการชักนำให้เกิด embryogenic callus จากชิ้นส่วนของใบ และ
การใช้สารเร่งการเจริญในกลุ่มของ cytokinin เช่น BA แสดงบทบาทอย่างชัดเจนในการชักนำให้เกิด adventitious shoots หรือเกิดเป็นต้นอ่อนจาก
embryogenic callus (Visessuwan. et al 1997)

                                                                                                    สรุปผล
             การทดลองนี้ประสบความสำเร็จในการถ่ายยีนสู่กุหลาบโดยใช้เชื้อ Agrobacterium tumefaciens   เป็นพาหะซึ่งเทคนิคที่ศึกษาสามารถนำไป
ดัดแปลงและปรับใช้ในการถ่ายยีนอื่นๆ ที่มีความสำคัญทางเศรษฐกิจ ( เช่น ยีนที่สังเคราะห์เอมไซม์ในการสร้างสีในกลีบดอก, ยีนชะลอการร่วงหรือยีนต้านทาน
ต่อโรคและแมลงเป็นต้น) ให้กับไม้ดอกเศรษฐกิจชนิดต่างๆเพื่อการปรับปรุงพันธุ์ให้ดีขึ้นต่อไป

                                                                                                  คำขอบคุณ
              ผู้วิจัยใคร่ขอขอบคุณ Prof. Dr. Masahiro Mii จาก Faculty of Horticulture, Chiba University ประเทศญี่ปุ่นที่ได้ให้คำปรึกษาและ
แนะนำให้งานวิจัยนี้ประสบผลสำเร็จด้วยดี

                                                                                                เอกสารอ้างอิง
Hamill, J. D., S. Rounsley , A. Spencer G. Todd, and M. J. C. Rhodes (1991) The use of the   Polymerase chain reaction
               in plant transformation studies. Plant Cell Rep. 10: 221-224.
Jefferson, R. A., T. A. Kavanagh, M. V. Bevan (1987) GUS fusion: b - Glueuronidase as a Sensitive and versatile
               gene fusion marker in higher plants. EMBO Journal 6: 3901- 3907.
Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989) Molecular Cloning, 2 nd Edition, Cold Spring Harbour Laboratory
               Press.
Visessuwan R., T. Kawai and M. Mii 1997 Plant regeneration systems from leaf segment culture through embryogenic
               callus formation of Rosa hybrida and R. canina . Breeding Science 47 (3):217-222.