ลาวัลย์ ชัยวิรัตน์นุกูล¹ สุรินทร์ ปิยะโชคณากุล¹
ประดิษฐ์ พงศ์ทองคำ¹  พัฒนา ศรีฟ้า¹ และอมรา ทองปาน²
1 ภาควิชาพันธุศาสตร์ 2 ภาควิชาวิทยาศาสตร์ทั่วไป คณะวิทยาศาสตร์
มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์

                                                                                      บทคัดย่อ
             การถ่ายฝากยีน WCI ให้กับข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 เพื่อศึกษาการแสดงออกของยีนนี้ในต้นข้าวแปลงพันธุ์ต่อแมลงบั่วและเพลี้ยกระโดดสีน้ำตาลด้วย
วิธียิงอนุภาคทองเคลือบดีเอ็นเอพลาสมิดที่มียีน WCI และยีน hpt เข้าไปในแคลลัสข้าว เมื่อเพาะเลี้ยงและคัดเลือกด้วยสารไฮโกรมัยซิน ได้ต้นข้าวแปลงพันธุ์จำนวน 44
หมายเลข ตรวจสอบดีเอ็นเอด้วยวิธี PCR และ Southern hybridization พบว่ามียีน WCI สอดแทรกอยู่ในจีโนมข้าวทุกหมายเลขและตรวจสอบอาร์เอ็นเอด้วยวิธี
Northern hybridization พบว่ามีต้นข้าวแปลงพันธุ์เพียง 10 หมายเลข ที่มีอาร์เอ็นเอของยีน WCIm ซึ่งเมื่อนำบางหมายเลขไปทดสอบกับแมลง บั่วและเพลี้ยกระโดดสีน้ำตาล พบว่า ต้นข้าวแปลงพันธุ์ที่นำมาตรวจสอบให้คะแนนการถูกทำลายน้อยกว่าต้นข้าวที่ไม่ได้รับการถ่ายฝากยีนและต้นข้าวที่เป็นพันธุ์อ่อนแอ อย่างไรก็ตามต้นข้าวแปลงพันธุ์ที่ได้มาทั้งหมดยังคงจัดอยู่ในประเภทพันธุ์อ่อนแอ

                                                                                   ABSTRACT
           Kunitz type chymotrypsin inhibitor gene (WCI) and hygromycin phosphotransferase (hpt) gene were transformed
into the callus of rice KDML 105 using DNA-coated gold particles. The expression of these genes through the resistance of
rice gall midge and brown planthopper was evaluated. Forty-four strains of hygromycin resistance plantlets were selected,
amplified by PCR, and identified by Southern hybridization. WCI DNA were found to be inserted in all of these rice genome.
However, using Northern hybridization to identify the existence of WCI RNA, it was found in only 10 plantlets of the total 44
transgenic rice. It was also seen that they were less damaged from rice gall midge and brown planthopper than the
controlled and those of weak strains. These transgenic rice plants, however, are still considered as susceptible strains.

                                                                                         คำนำ
              Chymotrypsin inhibitor จากถั่วพูเป็นสารออกฤทธิ์ต้านทานแมลงจากพืช ซึ่งทำหน้าที่ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ serine proteinase ที่จัดอยู่
ในกลุ่มเดียวกับ soybean trypsin inhibitor (Kunitz type) ตามที่ Gatehouse และคณะ (1979) ได้จัดแบ่งกลุ่มไว้ Kortt (1979, 1980), Shibata
และคณะ (1986, 1988) สกัดและศึกษาคุณสมบัติของ chymotrypsin inhibitor จากถั่วพู ซึ่ง Shibata และคณะพบว่า chymotrypsin inhibitor
มีคุณสมบัติในการยับยั้งเอนไซม์ chymotrypsin ในอัตราส่วนทางโมเลกุล (Molar ratio) เป็น 1:2 และเชื่อว่ามีตำแหน่ง reactive site 2 ตำแหน่ง Peyachoknagul และคณะ (1989) ศึกษา Kunitz type chymotrypsin inhibitor gene (WCI) จากถั่วพู พบว่ายีนนี้มีการแสดงออกในช่วงการพัฒนา
ของเมล็ด หลังดอกบาน 35-40 วัน และมีการแสดงออกในเปลือกของหัวใต้ดินทำหน้าที่ป้องกันอันตรายให้กับส่วนที่ใช้ในการสืบพันธุ์ของถั่วพูไม่ให้ถูกทำลาย
ไจากการกัดกินของแมลง ซึ่งยีนนี้ยังไม่มีรายงานการถ่ายฝากให้กับพืชชนิดใด แต่มีรายงานการถ่ายยีน CpTI จากถั่วผีซึ่งจัดอยู่ในกลุ่ม Bowman-Birk type
trypsin inhibitor ให้กับต้นยาสูบและพบว่าทำให้ต้นยาสูบต้านทานต่อหนอนยาสูบในอันดับ Lepidoptera และมีการทดลองผสมสารอินฮิบิเตอร์นี้เข้าไป
ในอาหารสังเคราะห์ให้แมลงศัตรูพืชเศรษฐกิจที่สำคัญ พบว่ามีผลต่อการเจริญเติบโตของแมลงหลายชนิด (Hilder และคณะ, 1990) ดังนั้นในการศึกษาครั้ง
นี้จึงได้ทำการถ่ายฝากยีน WCI ซึ่งยับยั้งการทำงานฃองเอนไซม์ serine proteinase เช่นเดียวกับยีน CpTI ให้กับข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 เพื่อศึกษาการ
แสดงออกของยีนนี้ในต้นข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 ต่อแมลงศัตรูข้าวบางชนิดและเพื่อเป็นแนวทางในการศึกษาการถ่ายฝากยีนด้วยวิธีใช้เครื่องยิงให้กับพืช
เศรษฐกิจชนิดอื่นต่อไป

                                                                           วัสดุอุปกรณ์และวิธีการ
               1. แคลลัสข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 (KDML 105) ซึ่งได้จากการเพาะเลี้ยงคัพภะบนอาหารสังเคราะห์ MS ดัดเเปลงที่เติมน้ำมะพร้าว 15 เปอร์เซ็นต์
เคซีนไฮโดรไลเซท 1 กรัมต่อลิตร น้ำตาลทราย 30 กรัมต่อลิตร วุ้นผง 0.8 เปอร์เซ็นต์ และ 2,4-D 2 มิลลิกรัมต่อลิตร
              2. สร้างพลาสมิดลูกผสม pKUG-WH ที่มียีน WCI ต่ออยู่กับโปรโมเตอร์ Actin 1-D และ nopaline systhase terminator (nos) และยีน
Hygromycin phosphotransferase (hpt) (ภาพที่ 1ก)โดยการตัดยีน WCI จากพลาสมิด pWCI-3b และยีน hpt จากพลาสมิด pGPTV-HPT
แล้วนำไปต่อแทรกเข้ากับพลาสมิด pDM 302
              3. การเตรียมอนุภาคทองเคลือบดีเอ็นเอพลาสมิดใช้วิธีซึ่งดัดเเปลงมาจาก Christou (1995) การถ่ายฝากยีนใช้วิธียิงพลาสมิดดีเอ็นเอ pKUG-WH
เข้าไปในแคลลัสข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 อายุ 3 สัปดาห์ ด้วยเครื่องยิงอนุภาคชนิด particle inflow gun (PIG) โดยใช้ความดันถังก๊าซที่ 600 PSI
ความดันก๊าซที่เครื่องยิง 45 PSI ระยะทางในการยิง 6 เซ็นติเมตร และใช้เวลาในการยิงแต่ละครั้ง 10 วินาที ซึ่งได้ทดลองก่อนหน้านี้แล้วว่าเป็นสภาพที่เหมาะ
สมต่อแคลลัสข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 และให้เปอร์เซ็นต์การเกิดต้นข้าวสูงสุด
             4. การคัดเลือกแคลลัสข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 ที่ได้รับการถ่ายฝากยีนโดยการนำแคลลัสที่ถูกยิงด้วยพลาสมิดดีเอ็นเอ pKUG-WH ไปเพาะเลี้ยงบน
อาหาร ไสังเคราะห์ MS ดัดเเปลงที่ใช้เลี้ยงแคลลัส และเติมสารไฮโกรมัยซิน 50 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตรเมื่อเห็นว่ามีแคลลัสสีขาวขนาดเล็กเจริญขึ้นมาใหม่จาก
แคล-ลัสก้อนเดิมให้ย้ายไปเพาะเลี้ยงบนอาหารสังเคราะห์ MS ดัดเเปลงสูตรชักนำให้เเคลลัสเจริญเป็นต้น และมีสารไฮโกรมัยซิน 50 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร
             5. ตรวจสอบต้นข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 ที่ได้รับการถ่ายยีนแล้วด้วยเทคนิค PCR และวิธี Southern hybridization โดยสกัดดีเอ็นเอจากใบของ
ต้น ข้าวที่ได้รับการถ่ายฝากยีนแล้วหมายเลขต่างๆ ตามวิธีของ Ying และคณะ (1992) แล้วนำไปทำ PCR ตามด้วย Southern hybridization โดยใช้ยีน
WCI เป็นโพรบ
             6. การตรวจสอบการทำงานของยีน WCI สกัดอาร์เอ็นเอจากใบข้าว โดยใช้น้ำยาสำเร็จรูป Trizol? Reagent ของบริษัท Life Technologies
แล้วตรวจสอบโดยวิธี Northern hybridization ตามวิธีซึ่งดัดเเปลงมาจากวิธีของ Krumlauf (1996) และใช้ยีน WCI เป็นโพรบ
             7. การตรวจสอบความต้านทานของต้นข้าวที่ได้รับการถ่ายยีนโดยทดสอบกับแมลงบั่ว (อันดับ Diptera) และเพลี้ยกระโดดสีน้ำตาล (อันดับ Hemoptera)
เลือกต้นข้าวที่ได้รับการถ่ายฝากยีนบางหมายเลขที่ตรวจสอบแล้วว่ามีการสังเคราะห์อาร์เอ็นเอที่เกิดจากยีน WCI ไปปลูกในเรือนเพราะชำที่ควบคุมสภาพแวดล้อมมิดชิด

                                                                             ผลและวิจารณ์
             หลังจากที่ยิงอนุภาคทองเคลือบพลาสมิดดีเอ็นเอที่มียีน WCI และยีน hpt เข้าไปในแคลลัสข้าวอายุ 3 สัปดาห์ จำนวน 1,200 แคลลัส ด้วยเครื่องยิงอนุภาค
และนำไปเพาะเลี้ยงบนอาหารสังเคราะห์ MS ดัดเเปลง สูตรเพาะเลี้ยงแคลลัสที่เติมสารไฮโกรมัยซิน 50 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตรพบว่ามีแคลลัสสีขาวขนาดเล็กเจริญ
ขึ้นมาใหม่บนแคลลัสก้อนเดิม (ภาพที่ 1ข) แสดงให้เห็นว่าเซลล์ที่มีพลาสมิด pKUG-WH เข้าไปจะสามารถมีชีวิตและเจริญเติบโตได้บนอาหารคัดเลือกที่มีสารไฮโกร-
มัยซิน ส่วนเซลล์ที่ไม่มีพลาสมิด pKUG-WH เข้าไปจะเปลี่ยนเป็นสีน้ำตาลและตายไปเพราะไม่มียีน hpt ที่มีคุณสมบัติต้านทานต่อสารไฮโกรไมซินนั่นเอง และเมื่อ
ย้ายแคลลัสที่เกิดใหม่นี้ไปเพาะเลี้ยงบนอาหารสังเคราะห์ MS ดัดแปลงสูตรชักนำให้แคลลัสพัฒนาไปเป็นต้นข้าวที่เติมสารไฮโกรมัยซิน 50 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร
พบว่าแคลลัสบางส่วนเจริญเติบโตเป็นต้นข้าวได้ (ภาพที่ 1ค) ซึ่งนับจำนวนได้ 82 ต้น แต่สามารถมีชีวิตรอดนอกขวดเพาะเลี้ยงเพียง 44 ต้น
            นำดีเอ็นเอของต้นข้าวทั้ง 44 หมายเลขมาตรวจสอบผลการถ่ายฝากยีนด้วยเทคนิค PCR และทำ Southern hybridization โดยใช้ยีน WCI เป็นโพรบ
พบว่าต้นข้าวทั้ง 44 หมายเลขมียีน WCI อยู่ในจีโนม (ภาพที่ 1ง ซึ่งแสดงเพียงบางส่วน) และเมื่อตรวจสอบการทำงานของยีน WCI ในต้นข้าวแปลงพันธุ์ทั้ง 44
หมายเลขด้วยวิธี Northern hybridization พบว่าต้นข้าวหมายเลข 2, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42 และ 43 มีการสังเคราะห์อาร์เอ็นเอจากยีน WCI
(ภาพที่ 1จ) ซึ่งการตรวจไม่พบในบางหมายเลขอาจมีผลมาจากการมีจำนวนชุดซ้ำของยีน WCI เข้าไปสอดแทรกอยู่ในจีโนมข้าวน้อย หรือยีน WCI สอดแทรกอยู่
่ในตำแหน่งที่ไม่เหมาะสม จึงไม่มีการแสดงออกของยีน ทำให้สามารถตรวจพบได้ด้วยวิธี PCR แต่ไม่สามารถตรวจพบด้วยวิธี Northern hybridization
            นำต้นข้าวหมายเลข 34, 35, 36 และ 37 ไปตรวจสอบการทำงานของยีน WCI ต่อแมลงบั่ว และเพลี้ยกระโดดสีน้ำตาล พบว่าต้นข้าวแปลงพันธุ์ทั้ง 4 หมาย
ให้เปอร์เซ็นต์การถูกทำลายของแมลงบั่ว คิดเป็น 37.50, 33.34, 36.67 และ 42.50 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ ซึ่งน้อยกว่าต้นข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิที่ไม่ได้รับการถ่ายยีน
และต้นข้าวพันธุ์ กข 1 ที่จัดว่าอ่อนแอต่อแมลงบั่วที่สุด ซึ่งให้เปอร์เซ็นต์การถูกทำลายคิดเป็น 68.97 และ 83.09 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับส่วนผลคะแนนการถูกทำลาย
โดยเพลี้ยกระโดดสีน้ำตาล พบว่าต้นข้าวหมายเลข 34, 35, 36 และ 37 ให้คะแนนการถูกทำลายคิดเป็น 7.11, 5.71, 6.50 และ 8.33 คะแนน ตามลำดับ ซึ่งน้อย
กว่าต้นข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 ที่ไม่ได้รับการถ่ายยีน และต้นข้าวพันธุ์ กข 7 ซึ่งเป็นพันธุ์ไม่ต้านทานต่อเพลี้ยกระโดดสีน้ำตาลโดยที่ทั้งสองให้คะแนนการถูกทำลาย
คิดเป็น 8.25 และ 8.56 ตามลำดับ แต่คะแนนมากกว่าต้นข้าวพันธุ์ CNT 1 ซึ่งเป็นพันธุ์ต้านทานต่อเพลี้ยกระโดดสีน้ำตาลโดยให้คะแนนการถูกทำลายคิดเป็น 6.01
คะแนน แสดงให้เห็นว่าสาร chymotrypsin inhibitor มีผลต่อการทำลายแมลงทั้งสองชนิด และมีผลต่อแมลงปากกัด (แมลงบั่ว) มากกว่าแมลงปากดูด (เพลี้ย
กระโดดสีน้ำตาล) อย่างไรก็ตาม ข้าวแปลงพันธุ์ทั้งหมดยังจัดอยู่ในกลุ่มพันธุ์อ่อนแอตามเกณฑ์การจัดกลุ่มต้านทานหรือไม่ต้านทาน ทั้งนี้อาจเป็นเพราะว่า จำนวนยีน
WCI ที่เข้าไปมีจำนวนชุดซ้ำน้อย หรือยังมีการแสดงออกได้ไม่สมบูรณ์

ภาพที่ 1   ก. โครงสร้างพลาสมิด pKUG-WH ซึ่งมียีน WCI และมียีน hpt แทรกอยู่ ข. แคลลัสที่มีพลาสมิด pKUG-WH แทรกอยู่จะสามารถเจริญเติบโต
                  ได้ในอาหารที่มีสารไฮโกรมัยซิน ค.   ต้นข้าวแปลงพันธุ์ที่เจริญพัฒนามาจากแคลลัสที่คัดเลือกแล้วว่ามียีน WCI และยีน hpt ง.  แสดงผลการตรวจสอบ
                  จีโนมของข้าวแปลงพันธุ์จำนวน 44 หมายเลข ด้วยวิธี PCR และ Southern hybridization โดยที่แถวที่ 1 คือ DNA marker แถวที่ 2 คือต้น
                  ข้าวที่ไม่ได้รับการถ่ายยีน แถวที่ 3 คือพลาสมิด pKUG-WH และแถวที่ 4-17 คือต้นข้าวแปลงพันธุ์หมายเลข 1-14 ตามลำดับ จ. แสดงผลการตรวจ
                  สอบการทำงานของยีน WCI ในต้นข้าวแปลงพันธุ์ด้วยวิธี Northern hybridization โดยที่แถวที่ 1 คือ ยีน WCI แถวที่ 2-5 คือ อาร์เอ็นเอของต้น
                  ข้าวเเปลงพันธุ์หมายเลข 34, 35, 36 และ 37 ตามลำดับ ฉ. และ ช. ต้นข้าวแปลงพันธุ์ที่ถูกแมลงบั่ว และเพลี้ยกระโดดสีน้ำตาลเข้าทำลายตามลำดับ                   

คำขอบคุณ
งานวิจัยครั้งนี้ได้รับทุนสนับสนุนบางส่วนจาก สถาบันวิจัยและพัฒนา มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ และมหาวิทยาลัยหัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ

Christou, P. 1995. DNA coating of gold for the particle bombardment. Rice transformation informal
                  workshop. CAMBIA. Australia. May 25-June 4.
Gatehouse, A.M.R., J.A. Gatehouse, P. Dobie, A.M. Kilminster and D. Boulter. 1979. Biochemical
                 basis of insect resistance in Vigna unguiculata J. Sci. Food and Agri: 30 948-958.
Hilder, V.A., A.M.R. Gatehouse and D. Boulter. 1990. Genetic engineering of crop for insect
                 resistance using genes of plant origin, pp. 5-66. In G.W. Lycett and D. Grierson (ed.)
                 Genetic Engineering of Crop Plants Butterworths.
Kortt, A. A. 1980. Isolation and characterization of the trypsin inhibitors from winged bean seed
                  (Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC.) Biochem. Biophys. Acta 577: 371-382.
Kortt, A. A. 1980. Isolation and properties of a chymotrypsin inhibitor from winged bean seed
                  (Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC.) Biochem. Biophys. Acta 642: 237-248.
Krumlauf, R. 1996. Methods in molecular biology, Vol. 58: basic DNA and RNA protocols, pp. 113-
                  128. In A.J. Harwood (ed.) Humana Press Inc., Totowa. N.J.
Peyachoknagul, S., Y. Habu. K. Umemoto, Y. Sakata and T. Ohno. 1989. Isolation,
                  characterization   and analysis of the express of chymotrypsin inhibitor gene in winged
                  bean (Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC.). Tokyo University of Agriculture and
                  Technology.
Shibata, H., S. Hara, T. Ikenaka and J. Abe. 1986. Purification and characterization of proteinase
                  inhibitors from winged bean (Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC.).seeds. J. Biochem.
                  99:1147-1155.
Shibata, H., S. Hara and T. Ikenaka. 1988. Amino acid sequence of winged bean (Psophocarpus
               tetragonolobus (L.) DC.).chymotrypsin inhibitor, WCI-3. J. Biochem. 104: 537-543.