ประเทศไทยเป็นแหล่งผลิตกล้วยไม้เมืองร้อนที่สำคัญของโลก มีการปลูกเลี้ยงคิดเป็นพื้นที่ประมาณ 17,500 ไร่ และทำรายได้ประมาณปีละ 2,000 ล้านบาท อุตสาหกรรมกล้วยไม้ไทยกำลังเผชิญปัญหาการขาดแคลนกล้วยไม้พันธุ์ใหม่ๆ ที่มีสีดอกแปลกตา แนวทางแก้ไขก็คือการแสวงหาพันธุ์ใหม่ เทคนิคทางพันธุวิศวกรรมจึงเป็นทางเลือกในการปรับปรุงพันธุ์ของดอกกล้วยไม้ โดยเฉพาะสีของดอกกล้วยไม้ให้มีความหลากหลายมากขึ้นกว่าพันธุ์เดิม เนื่องจากประเทศไทยยังขาดข้อมูลยีนสร้างสีดอกของกล้วยไม้ งานวิจัยในครั้งนี้จึงมุ่งเน้นในการโคลนยีนที่ควบคุมการสร้างสีดอกในกลุ่มแอนโทไซยานินของดอกกล้วยไม้สกุลหวาย และลูกผสมกล้วยไม้สกุลแวนด้า
          แอนโทไซยานินจัดเป็นฟลาโวนอยชนิดหนึ่งที่ประกอบด้วยสีของดอกไม้หลากหลายตั้งแต่สีส้ม สีแดงจนถึงสีม่วง และสีน้ำเงิน โดยทั่วไปการเกิดความแตกต่างของสีดอกเกิดจากปฏิกิริยาทางเคมีมากมาย ได้แก่ การไฮโดรไลซิส การเติมหมู่เมทธิล การเติมน้ำตาล แลการออกซิเดชัน หรือการรีดักชัน การสร้างสีของดอกไม้เริ่มจากกรดอะมิโนฟีนิลอลานินถูกเปลี่ยนแปลงโดยเอนไซม์ 8-9 ชนิด ได้แก่ phenyl alanine ammonia lyase (PAL), chalcone synthase (CHS), chalcone isomerase (CHI), flavonoid 3-hydroxylase (F3’H), dihydroflavonol 4-reductase (DFR), anthocyanidin synthase (ANS) และ flavonoid 3-glucosyl (3GT) หรือ UDP glucose-flavonoid  3-O-glucosyl transferase (UFGT) เอนไซม์เหล่านี้ทำหน้าที่เปลี่ยนสารไม่มีสีให้เป็นสารมีสีในกลุ่มแอนโทไซยานิน ที่มีอิทธิพลทำให้เกิดสีดอก (Holton and Cornish, 1995) ปัจจุบันได้มีการศึกษาเกี่ยวกับการปรับปรุงสายพันธุ์ดอกไม้ให้มีสีสันหลากหลายมากขึ้น เนื่องจากในธรรมชาติพืชเศรษฐกิจบางชนิดมีความหลากหลายของสีดอกน้อย ได้แก่ กล้วยไม้สกุลหวายตัดดอกที่มีลักษณะเด่นเป็นสีม่วงแดง เป็นต้น
            ผลจากการโคลนยีน 4 ชนิด ตั้งแต่เริ่มต้นของกระบวนการสร้างสีดอกจนถึงสิ้นสุดกระบวนการของกล้วยไม้สองสกุล คือ กล้วยไม้สกุลหวาย และลูกผสมกล้วยไม้สกุลแวนด้า พบว่ายีนที่โคลนได้ที่เกี่ยวข้องกับกระบวนสร้างสีดอกในช่วงต้น คือ ยีน Chalcone synthase (chs) มีลำดับนิวคลีโอไทด์เหมือนที่รายงานใน GenBankและ องค์ประกอบยีนควบคุมการสร้างเอนไซม์ Dihydroflavonal 4-reductase (dfr) เป็นเอนไซม์ในช่วงกลาง พบว่าลำดับกรดอะมิโน dfr จากดอกกล้วยไม้แวนด้าสายพันธุ์มิกาซาบลู มีความคล้ายคลึงกันกล้วยไม้ Bromheadia finlaysoniana ร้อยละ 84 เมื่อเปรียบเทียบด้วย (อุดมพร และ คณะ 2549)

 ภาพที่ 1  กระบวนการสังเคราะห์สารแอนโทไซยานิน (Holton and Cornish, 1995) และ ชนิดของยีนที่โคลนในกล้วยไม้ คือ  1. CHS, 2. F3’H, 3.DFR, 4. ANS/FLS
                   การเปรียบเทียบลำดับอะมิโนของสายโพลีเปปไทด์ DFR ของกล้วยไม้แวนด้า (Mikasa blue) กับข้อมูลกับพืช 16 ชนิด กล้วยไม้ Bromheadia .กล้วยไม้Oncidium กล้วยไม้ Cymbidium กล้วยไม้ Dendrobium ข้าวโพด คาร์เนชั่น. หน้าวัว. พิทูเนีย มันฝรั่ง องุ่น อะราบิดอปซิส แอสเตอร์ Gentiana ข้าวสาลี เยอบีร่า และ. ลิลลี่ จากการศึกษาความสัมพันธ์ของความเหมือนและแตกต่างกันขององค์ประกอบของโปรตีนโดยแสดงความสัมพันธ์เป็น phylogenetic tree โปรตีน DFR ในกล้วยไม้แวนด้ามีความใกล้เคียงกับกล้วยไม้ Bromheadia มากที่สุด แต่มีความแตกต่างจากข้าวโพดมากที่สุด ดังภาพที่ 2

ภาพที่ 2  Phylogenetic tree แสดงระดับความสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนของยีน dfr ในดอกกล้วยไม้แวนด้ากับ
โปรตีนของยีน dfr ในพืชชนิดอื่น

             นอกจากนี้ยังโคลนยีนในช่วงท้ายของกระบวนการสร้างสีดอก คือ F3H และ F3¢5¢H จากกล้วยไม้หวายแอสโคเซนด้า และ อัญชัน (วาสนา, 2547) โดย เอไซม์ Flavonoid 3¢, 5¢-hydroxylase  เป็นเอนไซม์ที่สำคัญในการสร้างรงควัตถุที่ให้ดอกไม้มีสีน้ำเงินหรือสีม่วง การโคลนยีน f3¢5¢h จากดอกอัญชันและดอกกล้วยไม้ไพน์ริเวอร์  เมื่อนำลำดับกรดอะมิโนของยีน f3¢5¢h จากดอกอัญชันและดอกกล้วยไม้ไพน์ริเวอร์มาเปรียบเทียบกันพบว่ามีความคล้ายคลึงกันคิดเป็นร้อยละ 90 และเมื่อนำลำดับกรดอะมิโนจากพืชทั้งสองชนิดไปเปรียบเทียบกับพืชชนิดอื่น พบว่ามีความใกล้เคียงกับเอนไซม์ F3¢H จากพิทูเนีย คิดเป็นร้อยละ 66 นอกจากนี้ยังสามารถโคลนยีน f3h จากดอกกล้วยไม้ไพน์ริเวอร์ เปรียบเทียบกับพืชอื่นพบว่ามีความใกล้เคียงกับเอนไซม์ F3H จากดอกกล้วยไม้ Bromheadia finlaysoniana คิดเป็นร้อยละ 94

ภาพที่ 3  Phylogenetic tree แสดงระดับความสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนของยีน f3h (ซ้ายมือ) River และ f3¢5¢h (ขวามือ) ในดอกกล้วยไม้ ของ Vancosylis Pine กับ โปรตีนของในพืชชนิดอื่น

            งานวิจัยครั้งนี้เน้นการโคลนยีน anthocyanidin synthase (ans) ที่เกี่ยวข้องกับขั้นตอนทางเคมีสุดท้ายของกระบวนการสร้างสารแอนโทไซยานินในดอกไม้ การรายงานครั้งนี้ ยีนใหม่ flavonal synthase (fls) ที่คล้ายกับยีน ans ได้โคลนจากดอกสีม่วงแดงของกล้วยไม้สกุลหวายเอียสกุล และดอกสีม่วงน้ำเงินของดอกสกุลแวนด้าลูกผสมมิกกาซา สายโพลีเปปไทด์ของเอนไซม์ FLS ที่ถอดรหัสของยีนโคลนจากกล้วยไม้ทั้งสองชนิดมีองค์ประกอบของกรดอะมิโน ความคล้ายคลึงกับโปรตีน FLS ร้อยละ 74-53 และ โปรตีน ANS ร้อยละ 50-46 ยีนที่โคลนได้นี้มีแนวโน้มที่เป็นเอนไซม์ฟลาโวนอยด์ที่เป็นกุญแจสำคัญต่อการเกษตรเพื่อการปรับปรุงสีดอกใหม่ของกล้วยไม้ในการศึกษาต่อไป อย่างไรก็ตามความสัมพันธ์ของโปรตีนที่ใช้ด้วยองค์ประกอบของโปรตีนเป็นหลักของศึกษาสามารถจัดจำแนกโปรตีน FLS และ ANS ออกเป็นสองกลุ่มเห็นได้ชัดเจน โดยมี FLS ของกล้วยไม้อยู่ระหว่างกลางดังแสดงให้เห็นโดย phylogenetic tree (ภาพที่ 4 )  

           เอนไซม์ FLS และ ANS มีความสำคัญต่อขบวนการสร้างสารแอนโทซัยยานิน เนื่องจากเอนไซม์ทั้งสองทำหน้าที่เปลี่ยนสาร dihydrokaempferol ซึ่งเป็นสารที่ไม่มีสีไปเป็นสีต่างๆได้ (Heller, 1985) แต่เอนไซม์ทั้งสองชนิดมีซับเตรตที่แตกต่างกัน โดย FLS มีซับเตรตเป็นสาร Dihydroquercetin และ Dihydromyricetin ส่วน ANS มีซับเตรตเป็นสาร Leucodelphinidin และ Leucocyanidin องค์ประกอบและลำดับของกรดอะมิโนของสายโพลิเปปไทด์ของเอนไซม์ทั้งสองชนิดมีที่คล้ายกันมาก มีความแตกต่างของโปรตีนในบางตำแหน่งเท่านั้น (Figure 3) โครงสร้างของโปรตีนที่แสดงความแตกต่างในแต่ละตำแหน่งถือเป็นประเด็นสำคัญที่ต้องศึกษาต่อไปในอนาคต โดยเฉพาะการศึกษาองค์ประกอบของยีนที่แยกจากล้วยไม้ซึ่งองค์ประกอบความคล้ายคลึงทั้ง FLS และ ANS

ภาพที่ 4  Phylogenetic tree แสดงระดับความสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนของยีน ans ในดอกกล้วยไม้หวายเอียสกุล และ มิกาซา กัยโปรตีนของยีน ans  และ fls  ในพืชชนิดอื่น

คำนิยม
คณะทำงานวิจัยขอขอบคุณโครงการทุนวิจัยมหาบัณฑิต กองทุนสนับสนุนการวิจัย (สกว.) ที่ให้ทุนงบประมาณสนับสนุนงานวิจัย และห้องปฎิบัติการเทคโนโลยีชีวภาพ สถาบันวิจัยจุฬาภรณ์  ที่ร่วมทำงานวิจัยและให้ความอนุเคราะห์ในการศึกษาลำดับนิวคลีโอไทด์