เทคนิคการตรวจวิเคราะห์สารฟอร์โบลเอสเทอร์

          สารพิษฟอร์โบลเอสเทอร์เป็นพิษในแง่ของการส่งเสริมให้เกิดมะเร็ง การอักเสบและการบวมของผิวหนังเมื่อสัมผัส สารนี้พบในน้ำมัน เนื้อ เปลือกเมล็ด กากของสบู่ดำจะประกอบสารพิษฟอร์โบล เอสเทอร์ที่เรียกว่า DHPB ที่เป็นไอโซเมอร์กัน 6 ชนิด โดยมีโครงสร้างพื้นฐานเป็น 12-deoxy-16-hydroxy phorbol (หมายเลข 1) และหมู่ R1 และ R2 ที่แตกต่างกันจึงทำให้ได้สูตรโครงสร้างของสารฟอร์โบล เอสเทอร์ที่แตกต่างกัน 6 ชนิด (หมายเลข 2 ถึงหมายเลข 7) โดยสูตรโครงสร้างหมายเลข 4 และหมายเลข 5 จะเป็น epimer กันซึ่งไม่สามารถแยกออกจากกันได้โดยวิธีทางโครมาโตรกราฟี โดยสูตรโครงสร้างต่างๆ ของ DHPB แสดงในรูปที่ 1

รูปที่ 1 แสดงสูตรโครงสร้างของสารฟอร์โบลเอสเทอร์ชนิด DHPB

                  การวิเคราะห์สามารถทำได้โดยใช้เครื่อง High performance liquid chromatography (HPLC) โดยใช้ UV เป็น Detector ซึ่งจะเกิดพีค (peak) ขึ้นห้าพีคในช่วงเวลา 8-12 นาที ดังโครมาโตรแกรม รูปที่ 2

รูปที่ 2 แสดงโครมาโตรแกรมของสารพิษฟอร์โบลเอสเทอร์ที่วิเคราะห์ด้วยเครื่อง HPLC-UV

             นอกจางนี้ยังสามารถวิเคราะห์ได้โดยใช้เครื่อง HPLC แล้วเปลี่ยน detector จาก UV เป็น Diode array detector (DAD) ซึ่งจะให้พีคเกิดขึ้น 4 พีคในช่วงเวลา 10-15 นาที ดังโครมาโตแกรมรูปที่ 3

รูปที่ 3 แสดงโครมาโตรแกรมของสารพิษฟอร์โบล เอสเทอร์ที่วิเคราะห์ด้วยเครื่อง HPLC-DAD

             การยืนยันสารพิษฟอร์โบล เอสเทอร์ สามารถทำได้โดยการวิเคราะห์โดยใช้เครื่อง HPLC-DAD-MS (High performance liquid chromatography-diode array-mass spectrometry) สามารถยืนยันชนิดของสารพิษฟอร์โบล เอสเทอร์แต่ละโครงสร้างที่เกิดพีค 4 พีคในรูปที่ 3 ได้โดยพิจารณาพีคหลัก (base peak) ของสเปกตรัมที่เกิดขึ้น ซึ่งพีคที่เวลา 10.54 นาที จะเป็นโครงสร้างหมายเลข 2 พีคที่เวลา 12.12 นาที จะเป็นโครงสร้างหมายเลข 3 พีคที่เวลา 13.71 นาที จะเป็นโครงสร้างหมายเลข 6 และพีคที่เวลา 15.70 จะเป็นโครงสร้างผสมหมายเลข 4, 5 และ 7 ของโครงสร้าง DHPB รูปที่ 1
การวิเคราะห์โดยใช้เครื่อง HPLC-DAD-MS จะมีประโยชน์ทั้งในการหาปริมาณและยืนยันว่ามีสารพิษฟอร์โบล เอสเทอร์ตกค้างอยู่ในสิ่งแวดล้อม รวมทั้งยืนยันพันธุ์ที่มีพิษและไม่มีพิษของสบู่ดำ

           การหาปริมาณสารฟอร์โบลเอสเทอร์ในส่วนต่างๆ ของสบู่ดำและในผลิตภัณฑ์ของสบู่ดำ
ปริมาณสารฟอร์โบล เอสเทอร์จะถูกวิเคราะห์โดยใช้เครื่อง High performance liquid chromatography (HPLC) โดยใช้ UV เป็น Detector พบว่าสารฟอร์โบล เอสเทอร์ที่ประกอบอยู่ในเปลือกเมล็ด เนื้อ น้ำมัน กาก ใบ น้ำมันไบโอดีเซล กลีเซอรอล และตะกอนที่ได้จากการตกตะกอนน้ำมันให้ใสจะประกอบด้วยสารฟอร์โบล เอสเทอร์ที่เหมือนกัน ซึ่งเกิดพีค (peak) ขึ้น 5 พีคในช่วงเวลา 8-12 นาที โดยสารฟอร์โบล เอสเทอร์ที่เหมือนกัน ซึ่งเกิดพีค (peak) ขึ้น 5 พีคในช่วงเวลา 8-12 นาที โดยฟอร์โบล เอสเทอร์นี้จะเป็นชนิดที่เรียกว่า DHPB ที่เป็นไอโซเมอร์กัน 6 ชนิด ส่วนสารฟอร์โบล เอสเทอร์ที่ประกอบอยู่ในลำต้น เปลือกผล เปลือกไม้จะเป็นสารฟอร์โบล เอสเทอร์ที่เหมือนกัน ซึ่งเกิดพีค (peak) 1 พีค ในช่วงเวลา 18-21 นาที โดยสารฟอร์โบล เอสเทอร์นี้จะเป็นชนิดที่เรียกว่า Phorbol-12-myristate-13-acetate (TPA) เมื่อคำนวณปริมาณสารฟอร์โบล เอสเทอร์เทียบกับสาร phorbol-12-myristate-13-acetate (TPA) จะแสดงผลดังตารางที่ 1

ตารางที่ 1 แสดงปริมาณสารพิษฟอร์โบล เอสเทอร์ที่ประกอบอยู่ในส่วนต่างๆ ของสบู่ดำ

การกำจัดสารฟอร์โบล เอสเทอร์ในน้ำมันสบู่ดำ

         การศึกษาการกำจัดสารฟอร์โบล เอสเทอร์ในน้ำมันสบู่ดำได้ทดลองโดยใช้การดูดซับด้วยเบนโทไนต์ ผลการทดลองพบว่าเมื่อดูดซับครั้งที่ 1 คือใช้ความเข้มข้นของเบนโทไนต์ 3.2% โดยน้ำหนัก ระยะเวลาในการดูดซับ 15 นาที อัตราเร็วในการกวน 100 รอบต่อนาที อุณหภูมิห้องสามารถลดปริมาณสารฟอร์โบล เอสเทอร์ในน้ำมันสบู่ดำได้ 96-98% และถ้านำน้ำมันภายหลังการดูดซับครั้งที่ 1 ไปดูดซับด้วยเบนโทไนต์ต่อครั้งที่ 2 พบว่าใช้ระยะเวลาในการดูดซับ 15 นาที อัตราเร็วในการกวน 100 รอบ/นาที ความเข้มข้นของเบนโทไนต์ 0.8% สามารถลดปริมาณสารฟอร์โบล เอสเทอร์ได้สูงสุดถึง 99.64%

         การศึกษาการล้างสารฟอร์โบล เอสเทอร์ออกจากเบนโทไนต์พบว่า เมื่อใช้อัตราส่วนของเบนโทไนต์ต่อปริมาตรเมทานอล 1:10 โดยน้ำหนัก ในสภาพที่เป็นกรด (pH = 4) กับสภาพที่เป็นกลาง (pH = 7) สามารถล้างเอาสารฟอร์โบล เอสเทอร์ออกมาได้ 97.46-98.22% แต่เปอร์เซ็นต์การสลายตัวของสารฟอร์โบล เอสเทอร์มีค่าสูงคืออยู่ในช่วง 89.88-95.67% แต่เมื่อล้างโดยใช้เมทานอลในสภาพที่เป็นเบส (pH = 13) พบว่าสามารถล้างสารฟอร์โบล เอสเทอร์ออกจากเบนโทไนต์ได้ 73.82% แต่เปอร์เซ็นต์การสลายตัวของสารฟอร์โบล เอสเทอร์มีค่าต่ำคือ 24.04% ซึ่งแสดงว่าการล้างด้วยเมทานอลในสภาพที่เป็นเบสมีความเหมาะสมในการผลิตสารสกัดฟอร์โบล เอสเทอร์เพื่อใช้เป็นสารกำจัดศัตรูพืช

การกำจัดสารฟอร์โบล เอสเทอร์ในกากสบู่ดำ

          การศึกษาการกำจัดสารฟอร์โบล เอสเทอร์ในกากสบู่ดำ ได้ทดลองโดยใช้การล้างด้วยเบสโปตัสเซียมไฮดรอกไซด์ เพราะสารละลายที่ใช้ล้างสามารถนำไปทำเป็นปุ๋ยได้ ผลการทดลองพบว่าสภาวะที่เหมาะสมคือใช้ความเข้มข้นของโปตัสเซียมไฮดรอกไซด์ 2% โดยน้ำหนัก อัตราส่วนกากสบู่ดำต่อน้ำเท่ากับ 1:5 ระยะเวลา 45 นาที อัตราเร็วในการกวน 100 รอบต่อนาที ที่อุณหภูมิห้องสามารถกำจัดสารฟอร์โบล เอสเทอร์ออกได้ 70-78% และเมื่อนำกากสบู่ดำไปแช่ใน 95% เอทานอลต่อเป็นเวลา 1 คืน ก็จะลดปริมาณสารฟอร์โบล เอสเทอร์ต่ำกว่า 0.011% ซึ่งเป็นปริมาณที่สามารถใช้เป็นอาหารสัตว์ได้