การเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในหลอดทดลอง
Polymerase Chain Reaction

         นำ PCR product ไปแยกแถบดีเอ็นเอโดยใช้กระแสไฟฟ้าโดยมีรายละเอียดดังนี้

การเตรียม 4% (2.5 Metaphor : 1.5 Seakem) agarose gel

  1. ใส่ 1X TBE buffer ปริมาตร 200 ml ลงใน Flask
  2. เติม 4% (2.5 Metaphore : 1.5 Seakem) agarose จำนวน 5 กรัม:3 กรัม
  3. นำไปปั่นช้าๆ ด้วยเครื่องกวนประมาณ 30 นาที
  4. ปิดปาก Flask ด้วยพลาสติกใส เจาะรูประมาณ 2-3 รู เพื่อระบายความร้อน
  5. นำไปเข้า microwave ในระดับ medium ประมาณ 5-6 นาที จนเดือด สลับกับนำมาปั่นช้าๆ ด้วยเครื่องกวนจน agarose ละลายหมด
  6. ปั่นช้าๆ ด้วยเครื่องกวนอีกครั้งจนอุณหภูมิลดลงประมาณ 60oC (ใช้เวลาประมาณ 15 นาที หรือจนฟองอากาศหายหมด)
  7. เท agarose ที่ละลายดีลงใน plate ที่เตรียมไว้ ประมาณ 1 ชั่วโมง agarose จะแข็งตัว จึงนำไปใช้ (ถ้าจะเก็บค้างคืนควรเก็บที่ 4oC โดยใส่ในถุงพลาสติก)

การใช้กระแสไฟฟ้าแยกขนาดของดีเอ็นเอ

  1. ใช้ 1X TBE buffer เป็น running buffer
  2. ใช้ Micro pipette ดูด PCR product 20 ml จาก plate ขนาด 96 หลุม ปล่อยลงในแต่ละหลุมของช่องหวีใน 4% (2.5 Metaphore : 1.5 Seakem) agarose gel (ใช้ 100 bp ladder 1 ml ความเข้มข้น 500 mg/ml เป็น standard marker)
  3. ใช้กระแสไฟฟ้า 100 โวล์ต ประมาณ 2-3 ชั่วโมง ในการแยกขนาดของดีเอ็นเอ

การย้อม แถบดีเอ็นเอ
           ย้อมเจลด้วย Ethidium bromide (10 mg/ml ปริมาตร 150 ml) ในน้ำกลั่น 700 ml นาน ประมาณ 20 นาที เขย่าเบาๆ ตลอดเวลา ล้างเจลด้วยน้ำกลั่นประมาณ 10 นาที (ระยะเวลาขึ้นกับจำนวนครั้งของเจลที่นำมาใช้ใหม่) อ่านแถบดีเอ็นเอโดยวางเจลผ่านแสง UV ความยาวคลื่น 302 nm. บันทึกภาพไว้ในเครื่องคอมพิวเตอร์


 

ชบา จำปาทอง และ ณัฏฐินี โปรดเมธี
สถาบันอินทรีจันทรสถิตย์เพื่อการค้นคว้าและพัฒนาพืชศาสตร์
ศูนย์วิจัยข้าวโพดและข้าวฟ่างแห่งชาติ
โทร. 044-361770-4