นำ
PCR product ไปแยกแถบดีเอ็นเอโดยใช้กระแสไฟฟ้าโดยมีรายละเอียดดังนี้
การเตรียม 4% (2.5 Metaphor : 1.5 Seakem)
agarose gel
- ใส่ 1X TBE buffer ปริมาตร 200 ml ลงใน Flask
- เติม 4% (2.5 Metaphore : 1.5 Seakem) agarose จำนวน 5 กรัม:3
กรัม
- นำไปปั่นช้าๆ ด้วยเครื่องกวนประมาณ 30 นาที
- ปิดปาก Flask ด้วยพลาสติกใส เจาะรูประมาณ 2-3 รู เพื่อระบายความร้อน
- นำไปเข้า microwave ในระดับ medium ประมาณ 5-6 นาที จนเดือด สลับกับนำมาปั่นช้าๆ
ด้วยเครื่องกวนจน agarose ละลายหมด
- ปั่นช้าๆ ด้วยเครื่องกวนอีกครั้งจนอุณหภูมิลดลงประมาณ 60oC (ใช้เวลาประมาณ
15 นาที หรือจนฟองอากาศหายหมด)
- เท agarose ที่ละลายดีลงใน plate ที่เตรียมไว้ ประมาณ 1 ชั่วโมง
agarose จะแข็งตัว จึงนำไปใช้ (ถ้าจะเก็บค้างคืนควรเก็บที่ 4oC โดยใส่ในถุงพลาสติก)
การใช้กระแสไฟฟ้าแยกขนาดของดีเอ็นเอ
- ใช้ 1X TBE buffer เป็น running buffer
- ใช้ Micro pipette ดูด PCR product 20 ml จาก plate ขนาด 96 หลุม
ปล่อยลงในแต่ละหลุมของช่องหวีใน 4% (2.5 Metaphore : 1.5 Seakem)
agarose gel (ใช้ 100 bp ladder 1 ml ความเข้มข้น 500 mg/ml เป็น
standard marker)
- ใช้กระแสไฟฟ้า 100 โวล์ต ประมาณ 2-3 ชั่วโมง ในการแยกขนาดของดีเอ็นเอ
การย้อม แถบดีเอ็นเอ
ย้อมเจลด้วย
Ethidium bromide (10 mg/ml ปริมาตร 150 ml) ในน้ำกลั่น 700 ml นาน
ประมาณ 20 นาที เขย่าเบาๆ ตลอดเวลา ล้างเจลด้วยน้ำกลั่นประมาณ 10 นาที
(ระยะเวลาขึ้นกับจำนวนครั้งของเจลที่นำมาใช้ใหม่) อ่านแถบดีเอ็นเอโดยวางเจลผ่านแสง
UV ความยาวคลื่น 302 nm. บันทึกภาพไว้ในเครื่องคอมพิวเตอร์
|